A evolução da PCR

As complexas questões atuais de pesquisa exigem uma profundidade de informação que ultrapassa a capacidade das tecnologias tradicionais da PCR. A terceira geração de PCR, a PCR digital ou dPCR, reduz essa lacuna por ser uma técnica muito mais simples e prática para abordar as questões de pesquisa cotidiana.

O conceito de PCR digital existe desde 1992 quando Sykes et al. a descreveu como “limitando a PCR de diluição”. Este método geral utilizou as análises finais e as estatísticas de Poisson para quantificar o número absoluto de moléculas de ácido nucléico presentes em uma amostra.

O que se seguiu foi o trabalho revolucionário de Vogelstein e Kinzler em 1999, que desenvolveram um método pelo qual a amostra foi diluída e distribuída em reações individuais chamadas partições, onde produtos únicos com sinais fluorescentes foram detectados e analisados após a amplificação. Eles então cunharam o termo “PCR digital”, como todos nós o conhecemos hoje.

Ao longo dos anos, este método tem passado por inovações e comercializado para uma adoção mais ampla. Pode-se realizar PCR digital em chips e discos microfluídicos, microarrays e microgotas ou cristais de gotículas baseados em emulsões de óleo/água e, mais recentemente, em placas tipo qPCR.

Introdução à dPCR – Saiba como funciona a tecnologia e o que ela pode fazer por você

A PCR digital é uma abordagem altamente precisa para a detecção e quantificação de ácidos nucléicos sensíveis e reprodutíveis. As medições são realizadas dividindo a amostra em partições, de modo que haja zero, uma ou mais moléculas alvo presentes em qualquer reação individual.

Cada partição é analisada após o ciclo de PCR estar completo para a detecção (reação positiva) ou ausência (reação negativa) de um sinal fluorescente, e então o número absoluto de moléculas presentes na amostra é calculado. Ela não depende de uma curva padrão para a quantificação do alvo da amostra. A eliminação da dependência das curvas padrão reduz o erro e melhora a precisão.

Quantificação absoluta em 4 passos

Diluição da amostra e configuração da reação de PCR

Azul – Alvo Vermelho – Fundo (gDNA, cDNA; primers/probes; master mix)

Partição da reação de PCR em milhares de reações individuais

Verde – Reações positivas Azul – Reações negativas

Amplificação das divisórias por PCR

Quantificação absoluta

Divisão e Conquista

Enquanto a amostra é preparada para qPCR, a partição da amostra, quando uma amostra é dividida em milhares de reações individuais antes da amplificação, é exclusiva da PCR digital. Através da distribuição aleatória das moléculas em partições, a PCR digital minimiza os efeitos dos concorrentes alvos e aumenta a precisão e o poder de sensibilidade da detecção, ao contrário da análise em massa na qPCR.

A dPCR permite que os (as) pesquisadores (as) façam:

•Quantificação dos alvos de baixa abundância ou alvos com fundos complexos
•Detectação e discriminação das variantes alélicas (SNPs)
•Monitoramento de pequenas mudanças nos níveis alvo, indetectáveis pelo qPCR

3 principais vantagens das partições

Aumenta a concentração efetiva

•Melhora o limite de detecção

•Amplifica e detecta moléculas single target

Efeito de enriquecimento

•Aumenta a relação – alvo vs. fundo

Fornece precisão e linearidade superiores

•Mensura moléculas individuais vs concentração em conjunto

Quanto mais partições, maior será a precisão

Quanto mais partições, maior o alcance dinâmico

Principais aplicações da PCR digital em nanoplaca

Garantia de resultados confiáveis desde o início

Graças à alta sensibilidade, precisão superior e quantificação absoluta, a PCR digital pode detectar alvos de baixa abundância, alvos em misturas complexas, variantes alélicas e monitorar pequenas diferenças nos níveis dos alvos em uma ampla gama de amostras e aplicações, incluindo mas não se limitando a:

•Detecção de patógenos microbianos
•Expressão gênica e análise miRNA
•Teste de águas residuais COVID-19
•Variação do número de cópias
•Detecção de mutações raras
•Validação do NGS
•Detecção de GMO

Workflow da dPCR em nanoplaca

Simplificando a era digital

Em apenas 3 passos simples e em menos de 2 horas, você pode ter o seu resultado: pipetar e carregar, rodar o equipamento, analisar os resultados.

Estamos comprometidos a simplificar o fluxo de trabalho para que você possa se beneficiar desta tecnologia.

Reproduzir vídeo

QIAcuity, como funciona?

Um fluxo de trabalho simples e rápido, baseado em placas

Assim como nos experimentos qPCR, o preparo de amostras inclui a transferência de master mix, sondas e primers para uma nano placa de 96 ou 24 poços, seguida pela adição de amostras. O sistema integra partição, termociclagem e imageamento em um único instrumento totalmente automatizado, que em menos de 2 horas traz um resultado.

Pode-se realizar análises no conjunto de software, fornecendo a concentração em cópias por microlitro de sua sequência alvo, bem como para o controle de qualidade, como amostras positivas ou NTC. Esta análise também pode ser estendida a computadores remotos dentro da mesma rede local (LAN).

QIAcuity Digital PCR System
Nome do Produto
Catálogo
QIAcuity One, 2plex Instrument
911000
QIAcuity One, 5plex instrument
911020
QIAcuity Four instrument
911040
QIAcuity Eight instrument
911050