Dpcr
A evolução da PCR
As complexas questões atuais de pesquisa exigem uma profundidade de informação que ultrapassa a capacidade das tecnologias tradicionais da PCR. A terceira geração de PCR, a PCR digital ou dPCR, reduz essa lacuna por ser uma técnica muito mais simples e prática para abordar as questões de pesquisa cotidiana.
O conceito de PCR digital existe desde 1992 quando Sykes et al. a descreveu como “limitando a PCR de diluição”. Este método geral utilizou as análises finais e as estatísticas de Poisson para quantificar o número absoluto de moléculas de ácido nucléico presentes em uma amostra.
O que se seguiu foi o trabalho revolucionário de Vogelstein e Kinzler em 1999, que desenvolveram um método pelo qual a amostra foi diluída e distribuída em reações individuais chamadas partições, onde produtos únicos com sinais fluorescentes foram detectados e analisados após a amplificação. Eles então cunharam o termo “PCR digital”, como todos nós o conhecemos hoje.
Ao longo dos anos, este método tem passado por inovações e comercializado para uma adoção mais ampla. Pode-se realizar PCR digital em chips e discos microfluídicos, microarrays e microgotas ou cristais de gotículas baseados em emulsões de óleo/água e, mais recentemente, em placas tipo qPCR.
Introdução à dPCR – Saiba como funciona a tecnologia e o que ela pode fazer por você
A PCR digital é uma abordagem altamente precisa para a detecção e quantificação de ácidos nucléicos sensíveis e reprodutíveis. As medições são realizadas dividindo a amostra em partições, de modo que haja zero, uma ou mais moléculas alvo presentes em qualquer reação individual.
Cada partição é analisada após o ciclo de PCR estar completo para a detecção (reação positiva) ou ausência (reação negativa) de um sinal fluorescente, e então o número absoluto de moléculas presentes na amostra é calculado. Ela não depende de uma curva padrão para a quantificação do alvo da amostra. A eliminação da dependência das curvas padrão reduz o erro e melhora a precisão.
Quantificação absoluta em 4 passos
Diluição da amostra e configuração da reação de PCR
Azul – Alvo Vermelho – Fundo (gDNA, cDNA; primers/probes; master mix)
Partição da reação de PCR em milhares de reações individuais
Verde – Reações positivas Azul – Reações negativas
Amplificação das divisórias por PCR
Quantificação absoluta
Divisão e Conquista
Enquanto a amostra é preparada para qPCR, a partição da amostra, quando uma amostra é dividida em milhares de reações individuais antes da amplificação, é exclusiva da PCR digital. Através da distribuição aleatória das moléculas em partições, a PCR digital minimiza os efeitos dos concorrentes alvos e aumenta a precisão e o poder de sensibilidade da detecção, ao contrário da análise em massa na qPCR.
A dPCR permite que os (as) pesquisadores (as) façam:
•Quantificação dos alvos de baixa abundância ou alvos com fundos complexos
•Detectação e discriminação das variantes alélicas (SNPs)
•Monitoramento de pequenas mudanças nos níveis alvo, indetectáveis pelo qPCR
3 principais vantagens das partições
Aumenta a concentração efetiva
•Melhora o limite de detecção
•Amplifica e detecta moléculas single target
Efeito de enriquecimento
•Aumenta a relação – alvo vs. fundo
Fornece precisão e linearidade superiores
•Mensura moléculas individuais vs concentração em conjunto
•Quanto mais partições, maior será a precisão
•Quanto mais partições, maior o alcance dinâmico
Principais aplicações da PCR digital em nanoplaca
Garantia de resultados confiáveis desde o início
Graças à alta sensibilidade, precisão superior e quantificação absoluta, a PCR digital pode detectar alvos de baixa abundância, alvos em misturas complexas, variantes alélicas e monitorar pequenas diferenças nos níveis dos alvos em uma ampla gama de amostras e aplicações, incluindo mas não se limitando a:
•Detecção de patógenos microbianos
•Expressão gênica e análise miRNA
•Teste de águas residuais COVID-19
•Variação do número de cópias
•Detecção de mutações raras
•Validação do NGS
•Detecção de GMO
Workflow da dPCR em nanoplaca
Simplificando a era digital
Em apenas 3 passos simples e em menos de 2 horas, você pode ter o seu resultado: pipetar e carregar, rodar o equipamento, analisar os resultados.
Estamos comprometidos a simplificar o fluxo de trabalho para que você possa se beneficiar desta tecnologia.
QIAcuity, como funciona?
Um fluxo de trabalho simples e rápido, baseado em placas
Assim como nos experimentos qPCR, o preparo de amostras inclui a transferência de master mix, sondas e primers para uma nano placa de 96 ou 24 poços, seguida pela adição de amostras. O sistema integra partição, termociclagem e imageamento em um único instrumento totalmente automatizado, que em menos de 2 horas traz um resultado.
Pode-se realizar análises no conjunto de software, fornecendo a concentração em cópias por microlitro de sua sequência alvo, bem como para o controle de qualidade, como amostras positivas ou NTC. Esta análise também pode ser estendida a computadores remotos dentro da mesma rede local (LAN).
Nome do Produto | Catálogo | QIAcuity One, 2plex Instrument
| 911000 |
|---|---|
QIAcuity One, 5plex instrument | 911020 |
QIAcuity Four instrument | 911040 |
QIAcuity Eight instrument | 911050 |
