A multiplexação em dPCR vem ganhando destaque como uma das estratégias mais eficientes para analisar múltiplos alvos genéticos em uma única reação, com precisão e economia de recursos.
Então, se você busca aumentar o rendimento dos seus ensaios sem comprometer a qualidade dos dados, entender como funciona essa técnica e como aplicá-la corretamente é essencial.
Multiplexação em dPCR: por que ela faz a diferença?
Ao realizar ensaios de PCR, é comum se deparar com a necessidade de analisar vários alvos simultaneamente. No entanto, métodos tradicionais, como a qPCR, têm limitações em relação ao número de alvos que podem ser processados com eficiência em uma única reação.
É justamente aqui que a multiplexação digital por PCR (dPCR) se destaca. Afinal, com ela, é possível fazer análises paralelas, em um único tubo de reação, sem comprometer a sensibilidade, especificidade ou reprodutibilidade dos resultados.
Anteriormente, era comum afirmar que a dPCR suportava até cinco alvos multiplexados com segurança. Mas, hoje, com os avanços tecnológicos e metodológicos, esse número já pode chegar a 12 alvos distintos em uma mesma reação.
Essa evolução foi possível graças à adoção de estratégias mais avançadas de multiplexação, como a chamada multiplexação por amplitude, que vai além do uso tradicional de diferentes cores fluorescentes (canais).
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O que é multiplexação por amplitude?
Em contraste com a multiplexação por cor, que detecta alvos com base em diferentes fluoróforos distribuídos entre canais ópticos distintos, a multiplexação baseada em amplitude permite identificar vários alvos dentro de um mesmo canal.
Isso é feito ajustando-se as concentrações das sondas, o que resulta em intensidades de sinal distintas para cada alvo. Em um gráfico de dispersão 1D (1D scatterplot), cada partição da reação de dPCR pode apresentar um dos seguintes estados:
- Negativa para ambos os alvos;
- Positiva para apenas um dos alvos;
- Positiva apenas para o segundo alvo;
- Positiva para ambos os alvos.
Então, ao utilizar concentrações específicas de sondas, são formados agrupamentos distintos de fluorescência, que o software reconhece e interpreta de forma precisa, mesmo quando vários alvos compartilham o mesmo canal óptico.
Essa abordagem aumenta consideravelmente a capacidade de multiplexação da dPCR, sem a necessidade de expandir os recursos do equipamento.
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6 dicas para começar com multiplexação por amplitude
Multiplexar 12 alvos em uma única reação de dPCR pode parecer um desafio, mas com os cuidados certos, é totalmente viável. Veja as dicas que vão facilitar essa jornada:
1. Otimize a concentração das sondas;
2. Escolha fluoróforos com cuidado;
3. Use reagentes apropriados para multiplexação;
4. Valide os ensaios em singleplex antes de multiplexar;
5. Implemente compensação personalizada de cross talk;
6. Ajuste os thresholds manualmente.
1. Otimize a concentração das sondas
Ajuste as concentrações das sondas para gerar agrupamentos fluorescentes bem definidos. Concentrações mais altas produzem sinais mais intensos, enquanto concentrações mais baixas resultam em sinais mais tênues.
Esse controle é essencial para diferenciar corretamente os alvos no mesmo canal.
2. Escolha fluoróforos com cuidado
Selecione corantes fluorescentes que reduzam a sobreposição espectral entre os canais, pois isso minimiza o risco de interferência cruzada. Caso utilize corantes com Long Stokes-Shift (LSS), verifique a compatibilidade total entre eles e siga atentamente as instruções de compensação óptica.
3. Use reagentes apropriados para multiplexação
Aposte em misturas desenvolvidas especialmente para multiplexação de alta ordem, como o QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit. Isso porque esse kit oferece uma química de tampão otimizada e concentração ideal de polimerase, proporcionando robustez e sensibilidade para reações complexas.
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4. Valide os ensaios em singleplex antes de multiplexar
Antes de combinar todos os alvos em uma única reação, valide cada sonda individualmente. Afinal, essa etapa assegura que cada ensaio funcione corretamente por conta própria, o que reduz erros e facilita o ajuste fino durante a multiplexação.
5. Implemente compensação personalizada de cross talk
O cross talk óptico ocorre quando um sinal fluorescente se espalha para um canal vizinho, causando leituras incorretas.
O sistema QIAcuity Digital PCR oferece a criação de uma matriz de cross talk personalizada (CXTM), permitindo assim, uma compensação eficiente das interações entre fluoróforos.
6. Ajuste os thresholds manualmente
O software da QIAcuity permite definir múltiplos thresholds por canal, o que aumenta a precisão na classificação das partições. Portanto, realize ajustes manuais para garantir que os agrupamentos de fluorescência estejam bem separados e corretamente interpretados.
Mais alvos, menos esforço
A multiplexação em dPCR representa uma verdadeira revolução para laboratórios que precisam de alta capacidade analítica com baixo consumo de amostra.
Com a possibilidade de detectar até 12 alvos em uma única reação, você amplia seu poder de análise sem aumentar tempo, custos ou complexidade.
Essa abordagem é especialmente vantajosa em áreas como oncologia molecular, detecção de patógenos, biomarcadores, farmacogenômica, bem como outras aplicações que exigem alta sensibilidade e especificidade.
Com as ferramentas certas e um bom planejamento experimental, a multiplexação de alta ordem em PCR digital pode transformar seus resultados e a eficiência do seu laboratório.
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Este conteúdo foi traduzido e adaptado de “How to dPCR multiplex a dozen targets without a dozen problems”. Conteúdo original publicado no perfil global QIAGEN.
Referências
QIAGEN. How to dPCR multiplex a dozen targets without a dozen problems. https://www.qiagen.com/es-br/knowledge-and-support/knowledge-hub/science-matters/pcr-solutions/how-to-dpcr-multiplex-a-dozen-targets-without-a-dozen-problems (acessado em 21 de maio de 2025).
